O YAC construído artificialmente deve possuir uma origem de replicação, locais de restrição e genes marcadores. Utiliza-se inicialmente um plasmídeo circular cuja cadeia é aberta por enzaimas de restrição, e com o auxílio de uma enzima ligase do DNA adicionam-se fragmentos de DNA (telómeros e centrómeros de cromossomas de levedura) e o gene de interesse.

Quando inserido banho-maria na célula hospedeira de levedura o YAC comporta-se como um cromossoma normal, sofrendo mitose e meiose.