O cDNA é utilizado para clonar genes de eucariontes em procariontes. Isto porque os procariontes não têm maturação do RNA logo fariam a redução de todo o DNA. Por exemplo, para expressar uma determinada proteína numa célula onde geralmente não é expressa (expressão heteróloga), transfere-se cDNA que codifica a proteína para a célula alvo. O cDNA também pode ser produzido por retrovírus, que o utilizam como mecanismo de infeção.

Síntese de cDNA numa célula eucariótica:

O método mais utilizado é a partir de mRNA maduro catalisado pela enzima Transcriptase reversa. A enzima atua no mRNA de cadeia simples gerando uma cadeia de DNA complementar.

1. o DNA é transcrito em mRNA
2. o mRNA sofre maturação e são removidos os intrões, e adicionados uma poli-A à extremidade 5’ e um grupo metil-guanina extremidade 5’
3. as várias moléculas de mRNA maduro são extraídas da célula
4. adiciona-se transcriptase reversa e nucleótidos, e a síntese do cDNA propriamente dita é iniciada
5. para sintetizar cadeias de DNA adicionais é necessário digerir a cadeia de RNA usando a enzima RNase A
6. após a digestão do RNA, o DNA de cadeia simples (_CSDNA) enrola dado que as cadeias simples de ácidos nucleicos têm propriedades hidrofóbicas.

O cDNA pode ser utilizado para criar bibliotecas de cDNA, que são arquivos das sequências dos mRNAs de uma dada célula ou organismo. Tendo a informação de uma biblioteca de cDNA para um organismo permite cloná-lo noutro organismo, o que é de extrema importância para reproduzir, por exemplo, proteínas importantes para os humanos em espécies não humanas.