Röntgen frequentou um internato, na Holanda, o Institute of Martinus Herman van Doorn. Aparentemente, Röntgen parece não ter sido particularmente estudioso. Existem algumas dúvidas sobre o seu percurso académico, até ter entrado na Escola Técnica de Utrecht, em 1862. Um incidente escolar fez com que Röntgen nunca fosse aceite como aluno da Universidade de Utrecht. No entanto, dois anos e meio depois, Röntgen conseguiu entrar no Politécnico de Zurique como estudante de engenharia mecânica, grau que obteve em 1868. Um ano depois, Röntgen já havia conseguido tirar o seu doutoramento. Röntgen tornou-se um assistente do físico August Kundt (1839 – 1894), acompanhando-o para a Universidade de Würzburg, em 1871, e para a Universidade de Estrasburgo. De seguida, tornou-se professor de física nas universidades de Estrasburgo (1876 – 1879), Giessen (1879 – 1888), Würzburg (1888 – 1900) e Munique (1900 – 1920).

Entre as investigações de Röntgen incluem-se trabalhos sobre elasticidade, capilaridade de fluidos, calores específicos de gases, condução de calor em cristais, absorção de calor por gases e piezoeletricidade.

Em 1895, ao fazer passar um fluxo de corrente elétrica num tubo de vidro com vácuo parcial (tubo de raios catódicos), Röntgen observou que um pedaço de platinocianeto de bário que se encontrava junto da montagem emitia radiação. Röntgen propôs que, quando os raios catódicos (eletrões) atingiam a parede de vidro do tubo, um certo tipo de radiação desconhecida era formada, que viajava por toda a divisão, atingindo o composto químico, causando a fluorescência. Investigações posteriores revelaram que a madeira, o papel e o alumínio, entre outros materiais, eram transparentes a esta nova radiação. Röntgen também descobriu que essa radiação afetava as chapas fotográficas. Devido à sua natureza incerta, Röntgen designou o fenómeno por radiação X, embora também se tenha tornado conhecida como radiação Röntgen. As primeiras radiografias de Röntgen foram realizadas à sua esposa.

Em 1901, Röntgen recebeu o primeiro Prémio Nobel da Física, que lhe foi atribuído em reconhecimento pelos extraordinários serviços que prestou pela descoberta dos raios-X. Röntgen, homem muito tímido, recusou dar o habitual discurso na cerimónia de aceitação do prémio. Röntgen morreu em 1923, aos setenta e sete anos. Em sua homenagem, designa-se por roentgen (símbolo R) a unidade da carga depositada na matéria pelo efeito ionizante dos raios X (e, também, raios gama, até 3 MeV): 1 R = 2,58 x 10^-4 C/kg.