As tecnologias de modificação de genomas têm como objetivo a alteração de uma sequência específica de DNA. A edição genética com fins biotecnológicos começou a ser aplicada nos anos 70 do século XX, com o estudo da recombinação homóloga, processo no qual uma sequência de DNA ladeada por regiões homólogas do DNA hospedeiro pode ser integrada no genoma deste¹. No entanto, a utilização direta desta técnica apresenta várias limitações, como a baixa eficácia de recombinação e a integração aleatória em zonas do genoma não desejadas². Para além disso, embora a utilização de organismos geneticamente modificados tenha um forte e positivo impacto no melhoramento de espécies vegetais com interesse económico, estas tecnologias não têm uma aceitação pública generalizada, em especial nos países europeus, o que tem dificultado a sua adoção^{3, 4}. A aplicação da recombinação homóloga no melhoramento de plantas envolve a adição de material genético numa planta de interesse, modificando assim o seu genoma, sendo que o material genético adicionado pode ser da mesma planta ou ser estranho à planta a ser modificada, que, neste último caso, passa a ser designada de planta transgénica⁵. A baixa frequência de integração num local específico desejado e a necessidade de utilizar genes marcadores e/ou de seleção limitam bastante a utilização das técnicas de recombinação genética⁶.

Com a evolução das técnicas de edição genética, foi possível desenvolver novos sistemas que não envolvem as antigas enzimas de recombinação, mas sim novas enzimas de restrição e nucleases reprogramáveis que estão no cerne das técnicas de edição genética atuais⁷. Para além disso, foi também crucial a associação entre as quebras na dupla cadeia do DNA (Double-Strand Breaks, DSB) e uma maior integração de DNA estranho no material genético de células de mamíferos^{6, 8}. A descoberta de meganucleases, enzimas de restrição com sequências de reconhecimento de 20 a 30 pares de bases (pb) envolvidas na duplicação de genes, deu-se em 1985⁹, mas foi nove anos mais tarde, com a descoberta das DSB, que estas enzimas foram associadas pela primeira vez à edição genética⁸. Após DSB, a maquinaria de reparação do DNA da célula repara a quebra: ou por ligação de extremidade não homóloga (Non-Homologous End Joining, NHEJ), inserindo ou retirando nucleótidos, o que pode levar a um knock-out do gene onde se deu a quebra; ou por reparação direcionada por homologia (Homology-Directed Repair, HDR), inserindo um fragmento de DNA fornecido à célula. No entanto, esta técnica envolve a síntese de uma meganuclease específica de cada fragmento de DNA alvo⁶. Também em 1985, foram descobertas pequenas proteínas que, devido à presença de um ião de zinco que estabiliza a ligação ao DNA e de um conjunto de motivos que se ligam a sequências de três pares de bases específicas do DNA alvo, apresentam uma elevada versatilidade na ligação ao DNA^{10, 11}. Em 1996, com a fusão destas proteínas a domínios de clivagem de DNA, foram criadas Zinc Finger Nucleases (ZFN)¹². Em 2010, novas nucleases programáveis foram concebidas, as nucleases efetoras semelhantes a ativadores de transcrição (Transcription Activator-Like Effector Nucleases, TALEN) ¹³, enzimas que juntam, também, enzimas de clivagem de DNA a módulos de ligação a nucleótidos de DNA¹⁴, sendo que nesta técnica cada módulo liga-se a um nucleótido, usando para tal apenas dois aminoácidos, o que torna a conceção destas nucleases bastante mais fácil do que as ZFN¹⁵. Todas estas técnicas envolvem a morosa tarefa de construção de novos domínios ou módulos proteicos para cada sequência alvo a editar⁶. Contudo, um novo sistema viria resolver este problema e revolucionar o mundo da engenharia genética, a técnica CRISPR/Cas.

Nos finais da década de 80 do século XX, foram observadas sequências de DNA repetidas no genoma de Escherichia coli, designadas repetições, e espaçadas regularmente por sequências não repetidas derivadas de vírus, os espaçadores¹⁶. Mais tarde, aquelas repetições foram também identificadas noutros genomas de bactérias e de Archaea (arqueias)¹⁷ e associadas a genes conservados que expressam endonucleases, passando este conjunto de repetições a ser denominado de Repetições Palindrómicas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespaçadas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, CRISPR)¹⁸. Posteriormente, os espaçadores foram, também, encontrados em genomas de fagos e noutros elementos genéticos estranhos^{19, 20, 21}, levando a que, por fim, o conjunto de repetições CRISPR fosse associado a um sistema de defesa bacteriano contra material genético estranho. Neste sistema, numa primeira infeção por uma dado material genético estranho (fase de imunização), este é fragmentado e inserido entre as repetições, constituindo os tais espaçadores do CRISPR que, numa segunda infeção pelo mesmo material genético (fase de imunidade), irão direcionar a nuclease Cas para o genoma invasor, cortando-o de forma precisa²². Para tal, a enzima Cas usa como guia um RNA transcrito dos espaçadores inseridos no seu genoma na fase de imunização, o RNA-guia, que então se liga por complementaridade ao DNA alvo da Cas, o material genético estranho desta segunda infeção^{23, 24}. Para que a enzima Cas o reconheça, este DNA alvo tem de estar adjacente a um motivo protoespaçador (Protospacer Adjacent Motif, PAM), fulcral para a clivagem do DNA alvo e para distinguir este DNA dos segmentos anteriormente incluídos no CRISPR^{25, 26, 27, 28} (FIGURA 1). Este sistema foi posteriormente adaptado para outras espécies e testado in vitro e in vivo^{29, 30, 31, 32, 33, 34}, constituindo assim uma tecnologia de edição de genomas bastante mais prática e económica do que as anteriores, pois apenas envolve a síntese de uma pequena molécula de RNA-guia para cada alvo a ser editado, tendo sido utilizado na edição de genomas de praticamente todos os organismos modelo⁶.

Relativamente à aplicação da técnica CRISPR/Cas na edição de genomas de espécies vegetais, este sistema tem sido utilizado para melhorar diversas características, como a produtividade e a gestão de stresse biótico e abiótico, em plantas com interesse económico, como o arroz, a cevada, o milho, o trigo, o algodão, o tomateiro, a soja, citrinos, a batateira, a videira, a melancia, a bananeira, a cenoura, leguminosas, a mandioca e a batata-doce³⁵. A expressão do gene da nuclease Cas, bem como dos RNA-guia nas células alvo, é suficiente para a modificação do genoma de interesse. Em 2013 iniciaram-se as primeiras edições de genomas de plantas, quer em dicotiledóneas com Arabidopsis thaliana³⁶, uma planta modelo, quer em monocotiledóneas com o arroz, Oryza sativa^{37, 38}. Enquanto que em Arabidopsis a primeira edição genética com esta tecnologia se centrou em provar que também funciona em plantas, tendo os autores mutado com elevada eficiência três genes relacionados com a fenologia da planta³⁶, no caso do arroz, embora o objetivo da investigação fosse também a prova de conceito, a função dos genes mutados está associada ao controlo de respostas a stresses bióticos e abióticos^{37, 38}.

Para além do seu interesse económico, o tomateiro é uma espécie ideal para testar técnicas de edição genómica dada a disponibilidade de métodos de transformação eficazes, a caracterização genómica já alcançada nesta espécie e a existência de um grande historial de melhoramento⁴⁰. No que toca ao melhoramento de qualidade, esta planta já foi alvo de várias intervenções usando a técnica CRISPR/Cas, como obtenção de frutos partenocárpicos⁴¹, ⁴², aumento do tempo de prateleira⁴³ e aumento de produtividade^{44, 45}. Num dos estudos mais impactantes de edição do genoma do tomateiro, foi possível através da técnica CRISPR/Cas mutar a zona autoinibitória da enzima descarboxilase do glutamato⁴⁶, responsável pela produção de ácido gama-aminobutírico (Gamma-AminoButyric Acid, GABA) a partir do glutamato, levando à acumulação de GABA no tomate. GABA é um aminoácido não proteico com benefícios para a tensão arterial. Um estudo posterior envolveu a criação de um mutante para quatro genes relacionados com o metabolismo do GABA, levando também à sua acumulação⁴⁷. Graças a estes melhoramentos, o tomate enriquecido em GABA foi o primeiro alimento editado pela técnica CRISPR/Cas a entrar no mercado⁴⁸. No controlo de respostas a stresses, a utilização de dois RNA-guia na edição do gene Mildew Resistant Locus O (MLO), gene com um grande impacto na suscetibilidade ao fungo Oidium neolycopersici, fungo responsável pela doença do oídio no tomateiro, permitiu uma deleção de 48 pb neste gene e, consequentemente, a resistência a este fungo, criando a variedade não transgénica Tomelo^{45, 49}.

No entanto, a técnica CRISPR/Cas apresenta alguns desafios. Já na fase inicial de experiências de edição genómica por CRISPR/Cas duas abordagens foram testadas relativamente à transformação de plantas com o vetor que contém o gene da Cas e os RNA-guia: em Arabidopsis o método optado foi o floral dip⁵⁰, segundo o qual os botões florais nas suas fases iniciais de desenvolvimento são mergulhados numa solução contendo bactérias da espécie Agrobacterium tumefaciens previamente transformadas com o plasmídeo contendo os genes que expressam a endonucleases Cas9 e os RNA-guia utilizados³⁶; por outro lado, nos primeiros estudos com o arroz, o método seguido foi a transformação química de protoplastos^{37, 38} e o bombardeamento de calli³⁷. Aqui encontramos um dos desafios da técnica CRISPR/Cas, a escolha do método de transformação da espécie desejada, que terá em conta quer o processo de regeneração, quer a transmissão da mutação induzida às gerações seguintes. Geralmente, as mutações originadas em Arabidopsis por esta técnica, quando o método de transformação utilizado é o floral dip, apresentam uma baixa taxa de transmissão às gerações seguintes, devido à utilização de promotores constitutivos na regulação da expressão da enzima Cas⁵¹. A adoção de enzimas Cas, cujo gene é regulado por um promotor específico das células germinativas, resolveu este problema⁵². Por outro lado, no caso descrito no arroz a fase de transformação ocorreu em culturas de tecidos utilizando a totipotência das células para potenciar a transmissão da modificação⁵¹. No entanto, nem todos as plantas de interesse económico são facilmente regeneradas a partir de culturas de tecidos, como as leguminosas, tendo já sido desenvolvidos diferentes protocolos otimizados de regeneração em diferentes espécies⁵³. Para espécies recalcitrantes têm sido desenvolvidos novos sistemas vetoriais dos genes necessários ao CRISPR/Cas, como a edição genómica induzida por genes virais, onde vetores baseados em vírus são replicados na planta infetada, propagando a mutação por todo a planta incluindo nas células germinativas, e a edição genómica de linhas elite por cruzamento com linhas mutadas menos recalcitrantes⁵⁴. Relativamente ao complexo Cas-RNA-guia e à sua especificidade, as mutações efetuadas pela enzima Cas em genes inespecíficos constituem um dos grandes problemas da técnica e apoiam alguns argumentos éticos contra a sua utilização, principalmente quando empregue em espécies com genomas grandes e onde a totalidade do genoma não é conhecida⁵⁵. Embora os RNA-guia contenham 20 nucleótidos o mais específicos possível para o gene que se pretende mutar, outros aspetos, como a estrutura do RNA-guia, o local PAM escolhido e a estrutura final do complexo RNA-guia – Cas-gene alvo podem afetar a especificidade do corte efetuado pela endonuclease. A utilização de endonucleases modificadas de elevada fidelidade, rácios Cas/RNA-guia otimizados, plataformas de desenho de RNA-guia mais fiéis e genomas de referência de elevada qualidade podem solucionar este problema. Também a introdução de genes estranhos por HDR após o corte da Cas apresenta grandes dificuldades em eucariotas no que toca à precisão e exatidão da inserção. Algumas das soluções consistem em desligar por mutagénese os mecanismos de NHEJ, ou expressar enzimas de modificação do DNA no genoma de interesse, com o intuito de modificar a sua tipologia e facilitar a HDR, ou ainda a utilização de outros estimulantes deste processo⁵¹.

Em conclusão, embora os organismos modificados pela técnica CRISPR/Cas sejam considerados organismos geneticamente modificados (OGMs) de acordo com a legislação em vigor na União Europeia, o facto é que, ao contrário dos organismos transgénicos em que um gene com função conhecida é transferido de um organismo para o outro, sendo integrado aleatoriamente no genoma do segundo, nos organismos geneticamente editados segmentos muitos específicos do seu DNA são alterados com vista a alterar a função ou expressão do gene alvo, não havendo necessariamente inserção de um gene estranho no genoma do organismo. Aparentemente a técnica CRISPR/Cas apresenta apenas duas grandes preocupações quanto à sua aplicação em biotecnologia vegetal e no melhoramento de plantas: as mutações inespecíficas e a deriva genética. Quanto às primeiras, e como já foi referido, para além desta técnica apresentar uma maior fidelidade relativamente às técnicas de edição genómica anteriores, são atualizadas com frequência novas ferramentas que aumentam a fidelidade da técnica e novos genomas são conhecidos mais profundamente, evitando os erros das mutações inespecíficas. Quanto à deriva genética, embora a introdução de edições no genoma transmissíveis à descendência possa alterar drasticamente o pool genético e causar distúrbios em espécies silvestres, a reversão desta situação com a reintrodução da sequência original do gene editado pode resolver este problema⁵⁷. Assim, embora alguns pormenores e especificidades da técnica CRISPR/Cas possam ser melhoradas, a potencialidade que apresenta para a modificação de genomas será muito importante no melhoramento de plantas num futuro próximo, principalmente com o aumento do número de espécies vegetais com o genoma sequenciado.